内质网定位表达载体（阳性对照，哺乳动物细胞）

产品信息

产品描述

重组蛋白功能研究时，常需要将其在细胞内定位到具体的细胞器，例如细胞核（nucleus）内、细胞质（cytoplasm）内、线粒体（mitochondria）或内质网（endoplasmic reticulum）上等。而细胞内某种蛋白的存在部位取决于蛋白序列中的“定位序列”（targeting sequences）或“信号肽”，这些序列可能位于蛋白质的N端、C端或蛋白质内部。一旦蛋白质被转运到最终细胞部位，这些序列可能会被保留，也可能被切除。研究者可以根据自己的研究目的，将感兴趣的ORF片段构建到表达载体中进行研究。

pCMV/myc/ER/GFP细胞质定位表达载体（阳性对照，哺乳动物细胞）是以pcDNA3.0为基本骨架改造的质粒，可进行哺乳动物细胞瞬转和稳转，它在细胞质内高水平表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）。作为细胞质定位载体的阳性对照质粒，它可用于优化细胞系转染条件，帮助确认目的蛋白在细胞质内的表达。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。

-20℃保存。有效期半年。长期保存，请保存于-80℃。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本载体在绿色荧光蛋白C端加有Myc标签。

3）大多数培养基由于含有核黄素而发荧光，干扰GFP荧光检测。因此，荧光检测时，应去除培养基，用PBS洗3次左右。

4）质粒转染后，应建立时间梯度摸索检测细胞GFP的最佳时间，以判定转染效率。因转染细胞类型的不同，时间优化在转染后12 h至96 h不等。

pCMV/myc/ER MCS

【注1】：pCMV/myc/ER/GFP是pCMV/myc/ER质粒在PstⅠ限制性内切酶和NotⅠ限制性内切酶双酶切后的部位插入GFP基因改造而得。

【注2】：信号肽包含一个内含子和两个外显子。蛋白表达过程中，内含子被切除，剩下信号肽的两个外显子及重组蛋白。

【注3】：编码重组蛋白的目的基因CDS区位置需在内质网信号肽的第二个外显子后，即BssHⅡ至NotⅠ多克隆酶切位点之间。

【注4】：带有信号肽的重组蛋白一旦转移进入内质网，便会在丝氨酸处切割掉信号肽，若带有内质网滞留信号（ER retenti-on signal，SEKDEL），则蛋白就位于内质网中。利用此质粒表达的重组蛋白C端带有SEKDEL肽和c-myc标签，因此重组蛋白分子大小会增加约2 kD。

【注5】：若基因CDS包含终止密码子，则重组蛋白不带有SEKDEL肽和c-myc标签，此时需根据蛋白本身性质定位蛋白，如果该蛋白为分泌蛋白，则该蛋白会分泌；而如果该蛋白为非分泌蛋白，则该蛋白可能会非特异性的停留在内质网中。

【注6】：使用BssHⅡ酶切位点时，应注意内质网信号肽（ER signal peptide）完整性。因此，设计引物时，应在上游引物 5’端添加 BssHⅡ酶切位点至定位序列的最后一个碱基。

【注7】：pCMV/myc/ER质粒上游测序引物为pCMV Forward primer，序列为5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；下游测序引物为BGH Reverse primer，序列为5’- TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’。