地高辛随引物标记和检测试剂盒Ⅱ(AP)

中文名称：地高辛随引物标记和检测试剂盒Ⅱ(AP)
英文名称：
产品规格：1盒
保存条件：-20℃冰冻保存。
保存期：一年
用途：用于 DNA 探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。
工作量：可用于标记0.1—3μg的探针6次及1000张切片的原位杂交或12次10×10cm 膜上杂交检测。
原理：
所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物 ，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA 链。以地高辛标记的探针与靶基因 DNA 链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测一般用碱性磷酸酶系统，BC1P/NBT 显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。
试剂盒内容：
1．DIG Random Labeling Mix(高效),25μl
2．Anti-DIG-AP Conjugate,100μl
3．BCIP/ NBT Stock Solution,1ml
4．Blocking Reagent,5g
特点：
(1)标记属高效标记反应。以 1μg DNA 探针为例，1 小时反应即可产生 0.8μg标记探针，20 小时可产生 2μg 左右的标记探针。
(2)试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和 Klenow 酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。
(3)标记反应适于下述对象：
a.DNA 从 10ng—3μg。
b.不等的DNA 长度 100bp—10kb。
c.线形排列或呈高度卷曲之 DNA。
d.低融点琼脂中的DNA。
(4)检测系统抗体为抗地高辛单抗，标记碱性磷酸酶。效价 1：5000(膜上杂交)或1：500(原位杂交)。
(5)显色剂为BCIP/NBT，两种成分混合后保存于 67%DMF 中，非常稳定。用时 1：50 稀释。
(6)试剂盒敏感性达到 0.1pg，足够检测出 1μg 基因组 DNA 中的单个基因。
(7)除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。
操作程序：
一 随机引物标记操作程序如下：
①用灭菌去离子蒸馏水稀释 1μg DNA 至总体积 16μl。
②DNA 热变性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10分钟。然后，迅速地插入碎冰中 3分钟以上。
③加 4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心 2000/r.p.m×5分钟。
④置 37℃反应至少 120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至 20 小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。
⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。
二 核酸探针膜上杂交原理和操作
(一)杂交总原则
脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成 DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成 DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA 双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA 单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。
(二)杂交膜的选择
杂交膜可以选择**纤维素膜和尼龙膜。**纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。
(三)探针浓度
探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。
所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移 DNA的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不同浓度的探针可以参考下述方法配制：取 5μl标记反应液加 1ml 探针稀释液，混匀。取 0.5ml 等倍释后，再取 0.5ml 继续等倍稀释。
假设 20μl 标记反应液中含 1μg 标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：
200ng/ml、100nt/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)预杂交和杂交液
预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：
① Standard buffer ：5 × SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
② Standard buffer+50% formamide ∶ 50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
③ High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5 × SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA 片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975 年 Southern 发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链 DNA 转移到**纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。 Southern 印迹杂交包括两个主要步骤①把电泳分级的DNA 转移到固相支持膜上。②与标记的DNA 探针杂交。
1．Southern 转移
首先将 DNA 用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。
试剂
a.0.25M HC1
b.变性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和液：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M 柠檬酸钠,3M Nac1。
e.2×SSC：0.03M 柠檬酸钠,0.3M Nac1。
程序：
(1)将胶浸入 0.25M HC1 中 10分钟。HC1 处理的作用主要是通过去嘌呤使 DNA分子断裂，因而有利于高分子量 DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于 10kb的DNA 片段时可省略此步骤。
(2)进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。
(3)把胶浸入变性液中，室温浸泡 15分钟×2次。
(4)蒸馏水漂洗凝胶 2次。
(5)把胶浸入中和液中，室温泡 15分钟×2次。
(6)在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或**纤维膜。**纤维膜用 2×SSC 浸泡。
剪两张 Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。
(7)准备转移用平器和支架，平器中放 20×SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。
(8)依次放：处理好的凝胶，**纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g)
注意：要检查 PH 值，用硝纤膜时 PH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的DNA 难以被吸到**纤维膜上。
(9)于室温转移 12-20 小时。
(10)取出转移膜，用 2×SSC 漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。
(11)固定：可选择下述方法之一进行 DNA 固定
·紫外线固定：使用长波紫外线照射 10-20分钟，简单漂洗后干燥备用。
·尼龙膜置+120℃烘烤 30分钟。
·硝纤膜置真空烤箱中，80℃减压烘烤 2-2.5 小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，亦可在普通烤箱中 65-70℃烘烤 3-4 小时，也能达到固定目的。固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。
注意事项：
①转移液的盐浓度对转移具有一定影响。一般选择 20×SSC 快速转移。
10×SSC 转移速度较慢，对于高分子量 DNA(〉10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。
②转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。
③**纤维膜对于 0.5kb 以下的小分子 DNA 结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小
片时最好用尼龙膜。
2 ．Southern 印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择 5-25ng/ml，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。
试剂
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留 2-4mm 空隙。灌注杂交液的一边留 1cm 空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。
②根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交 4-20 小时：Standard buffer:
预杂交温度 65-68℃，Standard buffer+50% formamide:37-42℃，High SDS buffer:37-42℃。
③使用双链 DNA 探针时，沸水浴 10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。
按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度 5-25ng/ml 。按每 100cm2 膜加入至少 3.5ml 配制杂交液。
④使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交 16-20 小时。
⑤杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃ 10分钟以变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在68℃变性10分钟即可。
⑥取出杂交膜，用 Wash Solution I洗5分钟×3次。
⑦保温冲洗：用 Wash SolutionⅡ于 68℃冲洗15分钟×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此检测方法用于快速定性筛选 DNA。样品可以是纯化 DNA，也可以是细胞碎片 PCR扩
的DNA。预杂交和杂交方法与 Southern 基本一致，不同的仅是样品的处理不同。
试剂：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序
①将样本 DNA 稀释成不同浓度。
②将样本 DNA 于+95℃水浴 10分钟，迅速插入冰中。
③取 1μl 点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。
④用紫外线照射固定或+120℃烘烤 30分钟固定。
其后杂交步骤 Southern 相同
(七)BCIP/NBT 显色检测法
试剂：a.Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体。
b.BC1P/NBT 储备液：
c.冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
d.封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
e.显色缓冲液：0.1M Tris-Hcl,0.1M,Nacl,PH9.5。
f.TE 缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
①经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡 1分钟。
②用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭至少 60分钟。
③用封闭液(d)1：2500—5000 稀释 Anti-DIG-AP，例如 2μl Anti-DIG-AP 加至 5—10ml封闭液中(根据染**况而调整)。稀释液+4℃可稳定 12 小时左右。
④加 Anti-DIG-AP，37℃反应 60分钟。
⑤用冲洗液冲洗15分钟×3次，每次 100ml 。
⑥按 1：50 配制底物显色液：例如 100μl“BCIP/NBT 储备液”(b)加至 5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。
⑦显色缓冲液 20ml 平衡 2分钟后倾掉。
⑧加 10ml 底物显色液(100 cm2)。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免振动，以免出现显色带的移位。
⑨当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以中止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液(f)，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择是让膜干燥，颜色消退。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。
三 原位杂交
所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在 DNA、mRNA 水平的表达。
原位杂交技术最早 Pardue and Gall和 John etal。分别在 1969 年发现。最初，放射性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。
(一)染色体原位杂交的一般技术
1 玻片准备
为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖氨酸或APES 处理玻片。
2 固定
为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用 4%甲醛或Bouins 固定液固定 30分钟。应予注意的是，DNA和 RNA 虽然不和各种交联剂反应。但包围DNA.RNA的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加通透性的程序。
3 玻片上材料的预处理
a．内源性酶的灭活
如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用 1%H2O2/甲醇 30分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。
b.RNA 酶的处理—DNA-DNA 杂交时需要处理内源性 RNA。
内源性 RNA的存在，会由于 DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分钟。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1处理用 200mM HC1处理 20-30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。
可能与蛋白的抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。
d.去垢剂处理
在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate 等，同样有助于原位杂交技术。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶 K，溶于 20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分钟。蛋白酶 K 浓度依不同对象来确定。
例如对染色体和核的分离部分，可以用 1μg/ml 蛋白酶 K。
4 探针和靶基因的变性
对染色体 DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最佳的变性条件。
热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到 80℃，2分钟后取出冷却至 37℃。如果是组织切片，变性时间应达到 80℃10分钟5杂交后的冲洗标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用 2×SSC＋50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。
总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)。
6 免疫细胞化学
免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时，Tris-HC1 缓冲液含“Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。在标准的免疫反应程序中，先对染色体、细胞和组织进行封闭，然后用酶标抗体 37℃反应 30分钟(或室温 1-2 小时)。此后用含 Tween 20的缓冲液进行三次冲洗每次 5-10分钟。免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用 DAB 作显色剂。后者用 BCIP/NBT 作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。
7 影响原位杂交的主要因素
a.探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。
b.探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可接受背景的最高探针浓度。
c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。
d.碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。
e.冲洗条件
8 杂交标准条件
适于 DNA 探针＞100bp
⊙50%去离子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
TUNEology 波长可调检测卡盒-->