T7耐热高产RNA合成试剂盒

描述：T7 耐热高产 RNA 合成试剂盒可在体外高效合成多 种类型的 RNA，如 mRNA、lncRNA、shRNA 等。利用 T7 RNA 聚合酶 2.0识别T7 promoter（TAATACGACTCA CTATA G G）以方框中 G 碱基为起点开始转录，该试剂 盒可以将少量样本进行高效转录，单次反应可获得高达 150 μg 的产物，转录长度可达 5000nt 以上。利用该试 剂盒得到的 RNA 适用于多种下游应用，如 RNA 结构和 功能研究、核酸酶生物化学研究、RNase 保护分析探针、 印迹杂交、反义 RNA 及 RNAi 实验、微阵列分析、显 微注射、体外翻译和 RNA 疫苗等。 T7 耐热高产 RNA 合成试剂盒使用方便，有利于用户 快速建立反应。本试剂盒还配备了 DNase I，在 RNA 合 成完毕后可快速去除 DNA 模板，便于获得高纯度转录 RNA。组分中含有 T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0 可在 37-52℃条件下进行高效的体外转录，最佳温度为 37℃， 50℃反应条件下仍然保留 50%以上的活性。这种高温的 反应特性有益于以下几个方面的实验：（1）提升了 GC 含 量较高 RNA 的转录效率；（2）提升了长片段 RNA 的合 成能力；（3）在使用帽类似物时，提高了共转录的加帽效 率；（4）减少了 dsRNA 副产物的形成，降低了合成 RNA 的免疫原性。 原理： 组分： 名称 10T 50T 5×T7 Transcription Buffer 1ml 1ml # T7 2.0 Transcript Enzyme Mix 20 μl 100 μl rNTP Mixture（25mM each） 40 μl 200 μl RNase Free DNase I(10U/μl) 20 μl 100 μl 10×RD Buffer 1ml 1ml RNase Free H2O 1 ml 1 ml # 每 2μl 的 T7 2.0 Transcript Enzyme Mix 含有 100U T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0、20U Rnase Inhibitor、0.02U 热 稳定无机焦磷酸酶。 保存：-20℃可保存 2 年，避免反复冻融。 操作步骤： （1） 按以下组分配制反应液 5×T7 Transcription Buffer 4 μl 转录模板 DNA 0.2~1 μg rNTP（25mM each） 3.2 μl T7 2.0 Transcript Enzyme Mix 2 μl RNase Free H2O upto 20 μl 注：DNA 模板应为线性化 DNA, 无 RNase、蛋白、盐、 EDTA、A260/280 值在 1.8-2.0. （2）37℃-50℃反应1~3h，转录RNA产量在80~150μg。 （3） 转录完毕后，如需去除模板 DNA，20μl 反应液中 加入 5μl 的 10×RD Buffer、2μl 的 RNaseFree DnaseI 、 23μl 的 RNase Free H2O 至 50 μl，37℃孵育 15min。 （4）整个反应完毕后可取 0.2~0.5μl 转录产物进行电泳 检测，并采用 5min RNA Purification Kit 进行 RNA 的纯化（或经典 LiCl 沉淀法纯化）， 并保存于-80℃。

T7 RNA 聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，并可以其作为启动子，DNA作为模板体外合成正义链或反义链RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA 聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。 正义或反义RNA链取决于模板DNA序列与T7启动子的位置，DNA位于T7启动子的下游，T7 RNA聚合酶会转录出正义RNA，反之则为反义RNA链。 提供两种T7 RNA 聚合酶：野生型和耐热型。野生型T7 RNA 聚合酶可在37℃对模板进行高效体外转录，与野生型噬菌体 T7 RNA 聚合酶相比，T7耐热RNA聚合酶可在更高的温度下进行体外转录。它可在37-52℃条件下进行高效的体外转录，最佳温度为37℃，50℃反应条件下仍然保留50%以上的活性，而野生型在此温度下无活性。基于此耐热的体外转录反应特性具有以下优势：（1）提升了GC含量较高RNA的转录效率；（2）提升了长片段RNA的合成能力；（3）在使用帽类似物时，提高了共转录的加帽效率；（4）减少了 dsRNA 副产物的形成，降低了合成 RNA 的免疫原性; (5)提升NASBA和CRISPR核酸扩增检测性能。该系列酶均来自重组 E.coli BL21菌株纯化而得，无核酸酶污染。 T7耐热高产RNA合成试剂盒是基于T7 耐热RNA聚合酶而组建的试剂盒，产量超过 MegaScript T7 Transcription kit，可在体外高效合成多种类型的 RNA，如mRNA、lncRNA、shRNA等。利用T7 RNA 聚合酶2.0识别T7 promoter（TAATACGACTCA CTATA G G）以倒数第二个G碱基为起点开始转录，该试剂盒可以将少量样本进行高效转录，单次反应可获得高达150 μg 的产物，转录长度可达5000nt以上。利用该试剂盒得到的 RNA 适用于多种下游应用，如RNA结构和功能研究、核酸酶生物化学研究、RNase保护分析探针、印迹杂交、反义 RNA 及 RNAi 实验、微阵列分析、显微注射、体外翻译和 RNA 疫苗等。

应用

制备放射标记的 RNA 探针 合成用于体外翻译的 RNA 合成用于结构、加工和催化性能研究的 RNA 合成 RNA 反义链，调控基因表达

1X T7 Transcription Buffer

40 mM Tris (pH 7.8), 20 mM NaCl, 18mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 。

酶储存液

10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。

储存

-20°C可保存2年，避免反复冻融。

热失活

75°C，10min。

注意事项

1. 转录DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。 2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RnaseA会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板。 3. 该酶对高浓度NaCl或KCl不耐受，当其浓度高于 150mM时，其活性受到显著抑制（~50%）。 4. 在20μl反应体系中加入0.02U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量（提高25~50%）。

实例

1.野生型和耐热型T7 RNA聚合酶的耐热性能比较 以20ng DNA作为模板，分别在反应体系（20 μl）中加入100U的T7 RNA聚合酶和T7 耐热RNA聚合酶2.0进行体外转录，结果可见T7 耐热RNA聚合酶2.0在50°C仍具有较高活性，而野生型T7 RNA聚合酶在该温度下没有活性。

2.热稳定无机焦磷酸酶对转录产量的影响 在反应体系（20 μl）中加入0.02U的热稳定无机焦磷酸酶（货号C5007）可显著提高转录产物的产量。

3.以不同大小的线性化质粒作为模板，应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试 由结果可见：T7耐热RNA聚合酶2.0在50°C条件下仍具有理想的转录活性。

4.以不同大小的PCR产物作为模板，应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试 由结果可见：T7耐热RNA聚合酶2.0可有效转录>5000nt的RNA分子。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！