逆转录酶，1970年由Temin和Baltimore独立发现，它能将RNA转录成cDNA，二人因此获1975年诺贝尔生理学或医学奖。逆转录酶包含多个功能域，分别为聚合酶域和RNase H域，其中聚合酶域进一步细分为“手指”、“手掌”和“拇指”三个亚域，分别参与模板结合、催化反应和结构支持[1]。在分子生物学中，尤其分子诊断领域，逆转录酶不可或缺。它可将病毒RNA基因组转为cDNA，再通过RT-qPCR、RT-LAMP、RNA测序等技术进行检测，这一特性使得对诸如艾滋病、甲型流感以及乙型流感这类RNA病毒进行准确诊断成为可能。
图1. 逆转录酶蛋白结构及其活性[2]
目前M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶是分子诊断试剂中最常用的逆转录酶，然而，M-MLV逆转录酶在高温条件下表现出相对较低的稳定性，易发生失活现象。这一特性不仅对由其配制的预混液在长期储存过程中的性能保持构成挑战，同时也限制了其在需要较高温度下进行逆转录反应的应用，因此提升逆转录酶的稳定性是一个重要研究方向。
翌圣团队凭借其子公司镁孚泰生物ZymeEditor™创新型酶进化平台，通过一系列干湿实验的交互筛选，成功获得了稳定性提高的M-MLV突变体。在研发阶段，团队一方面采用了理性/半理性设计的策略，对MMLV进行了多维度、多层次的结构-功能分析。基于序列一致性分析、B-factor分析、吉布斯自由能变化分析以及二硫键设计等手段，确定结构中的热点氨基酸，并设计能够稳定结构的定点突变，输出稳定性提升的M-MLV优势突变体。
图2. 理性与半理性设计改造M-MLV稳定性：(A) 理性与半理性设计及筛选过程；(B) 突变位点设计；(C)加速稳定性表征数据
接着，团队利用MTPS高通量筛选技术，对稳定性、RNA/DNA催化的偏好性以及活力都进行了多维度筛选，最终获得了具有性能提升的优势突变体。通过对这些突变体进行精细纯化，并对其性能进行全面的酶学表征，最终成功获得了多个cDNA产量显著提升（接近3倍）的突变体。而且M-MLV突变体与对照WT的预混液保存6个月和12个月后的建库产量对比数据表明，M-MLV突变体的建库产量优于对照WT，说明M-MLV突变体稳定性更优。
图3. (A) 改造RNA和DNA依赖的DNA聚合酶活性提高cDNA产量; (B) M-MLV突变体与对照WT的cDNA产量对比; (C) M-MLV突变体与对照WT的预混液保存6个月和12个月后的建库产量对比
团队的这项研究获得了多个稳定性和cDNA产量提升的M-MLV突变体，为分子诊断试剂的开发提供了新的解决方案。通过对这些进化突变体进行全面的性能评估，包括加速稳定性测试、预混试剂的稳定性、灵敏度分析以及冻干技术的应用，我们精心挑选出综合性能最优的突变体进行产业化生产。
今天我们隆重推出通过酶定向进化而来的新品逆转录酶：Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶（Cat#14614）。这款新型逆转录酶在稳定性方面实现了显著提升，同时其合成cDNA的产量、灵敏度也达到了更高的水平。此外，该产品由UCF.ME®超洁净分子酶生产基地生产，整个生产过程对物料、环境、工艺、过程、质量等多环节进行严格把控，确保极低的背景菌gDNA残留和核酸酶残留，为实验结果的准确性和可靠性提供了更有力的保障。
Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶性能展示
01
高灵敏
Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶能够保证在低浓度模板情况下，搭配快速程序（逆转录2 min）,仍能扩增特异性靶标，且Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶和同类竞品A相比，Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶对四个靶标的检测Ct值及荧光增幅，均优于竞品A。对于低浓度样本，也可实现精准检测，达到早筛早诊的目的。
图4. Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶和竞品A性能比较
02
全预混稳定性优异
使用Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶和竞品A，搭配相同的反应buffer，将HRV靶标3种型别引探与所有试剂组分提前预混，在37℃条件下放置5天，与-20℃正常保存的试剂，同时检测浓度为300 copies/µL的模板，结果显示，竞品A在热加速处理后出现Ct值延后、荧光值降低的现象，而Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶在37℃加速5天后，与-20℃正常保存的试剂相比，扩增曲线峰形、荧光值、Ct值都没有变化，Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶配制成的全预混体系稳定性更高，可解决当前全预混体系在长期储存过程中的性能难保持的问题。
图5. Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶和竞品A全预混稳定性比较
03
冻干后性能稳定
Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶除了能够保证在液体状态下的性能，其对应无甘油酶用于冻干后，依然能保持其优异性能。下图为Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶和竞品A分别配制成全预混体系冻干后性能测试结果，结果显示Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶配制成全预混体系冻干后对靶标的检测Ct值及荧光增幅，均优于竞品A。
图6. Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶和竞品A冻干后性能比较
04
E. coli基因组DNA残留＜0.02 copies/ 100 U
在诊断试剂开发过程中，由于市场上的分子酶原料的质量良莠不齐，核酸残留过高会影响扩增产物的特异性和准确性。经过实践发现，分子诊断关键酶原料只有在核酸残留极低（如Taq DNA聚合酶HCD ≤ 0.001copies/U）甚至达到无检出的水平才能满足日益提升的体外诊断试剂的性能需求。翌圣使用E. coli残留检测试剂盒检测Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶，三批次Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶E. coli检测结果均为未检出，符合E. coli基因组DNA残留＜0.02 copies/ 100 U标准，高标准的分子酶原料有助于提高样本的检测可靠性。
图7. Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶E. coli基因组DNA残留检测结果
05
建库性能优异
Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶能够保证在不同浓度RNA模板投入时，均能获得优异的文库产量，且得到的文库大小一致，说明除RT-PCR/qPCR应用外，该酶同样适用于NGS建库。
图8. Hifair UCF. ME® Advanced逆转录酶建库性能验证
订购信息
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产品名称 |
货号 |
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Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase (200 U/μL) |
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Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase, Glycerol-free (200 U/μL) |
14617ES |
翌圣逆转录酶突变体库
除商业化逆转录酶外，翌圣还拥有逆转录酶突变体库，可满足不同应用场景的需求。目前，已有多家合作伙伴对翌圣镁孚泰生物改造的逆转录酶突变体进行了试用，得到客户的高度认可。如您对我们的逆转录酶突变体感兴趣，可扫描下方二维码联系工作人员申请试用哦!
参考文献：
[1] Georgiadis M M, Jessen S M, Ogata C M, et al. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase[J]. Structure, 1995, 3(9): 879-892.
[2] Lown P S, Cai J J, Ritter S C, et al. Extended yeast surface display linkers enhance the enrichment of ligands in direct mammalian cell selections[J]. Protein Engineering, Design and Selection, 2021, 34: gzab004.