表观组学专题：ATAC-seq，你了解多少呢

一、染色质开放研究技术发展史

ATAC-seq作为表观组学研究技术之一，已经被很多组学专家所接受并已经在应用，那关于ATAC-seq技术，你了解多少呢？

要介绍ATAC-seq，不得不提到它的发展史。在染色质开放性研究领域，也是走了一段长长的路，这也是一条长江后浪推前浪的路。

DNase-seq：这项技术属于开放染色质研究的老前辈，它的开发主要是因为染色质区域有很多DNase I HS位点，DNase-seq依赖于DNaseI核酸酶的消化来识别核小体耗尽的开放染色质区域，在那里所有类型的因子都有结合位点，但它不能识别哪些特定的因子被结合【1】。

FAIRE-Seq：FAIRE-Seq的技术开发，其实是在经典DNA-蛋白互作技术ChIP-seq的基础上的技术衍生及应用。2007年，FAIRE-seq技术正式问世，它传承了ChIP-seq的甲醛交联和超声打断，所以整个实验操作时间周期较长，也有一定的实验困难【2-3】。

MNase-Seq也是在ChIP-seq的基础上进行的发展，MNase酶的应用也是在ChIP技术中替代超声的步骤时使用的。MNase-Seq技术是在应用FAIRE-seq时有理有据的迭代更新【4】。

ATAC-seq技术的发展得益于Tn5转座酶的研究，Tn5转座酶的应用，大大简化了开放染色质研究的时间，从最初2-3天的实验周期，缩短到2-3小时【5】。

图：不同染色质开放性研究技术对比，图片来源：Lee B. H. et al. 2021

Tn5酶的出现，确实是改变了表观技术研究的应用，ATAC-seq技术问世以来，大量的样本获得了较好的开放染色质区域的信息，转录因子调控更上一层楼。但是，Tn5酶最初的应用，不是在开放染色质研究，而是在DNA文库构建时的酶切片段化，Tn5酶的应用，使得超低浓度DNA建库成为可能，低至1ng的样本都能很好的建库。

图：基于Tn5酶的建库流程

二、ATAC-seq技术研究要点？

但是在应用时，我们会发现，常规Tn5建库试剂盒，明明是55℃酶切，为什么在进行ATAC-seq研究时，温度就变成了37℃？能不能也进行55℃酶切？实际情况是37℃和55℃都是可以酶切实验，只是在55℃时，有些样本的开放状态可能会有影响，造成后续数据分析时背景噪音较高【7】，而37℃进行实验时，背景噪音普遍较低。当然，我们在真实实验时，也会发现有些样本37℃酶切效果不好时，也是可以考虑改变酶切温度。

除了以上介绍的内容，关于ATAC-seq，到底是在研究什么？数据分析时，要重点关注什么呢？

首先我们从ENCODE上公布的ATAC的数据质量标准来看看关注点：

1）实验需要设置至少2个生物学重复；对无法做生物学重复的样本至少2个技术重复

2）每个实验组需要有单端测序时15 M的clean reads或者双端测序50 M clean reads；

3）mapping率应最低80%；

4）用IDR值评判重复性；

5）NRF>0.9, PBC1>0.9, and PBC2>3评估文库复杂性；

6）peak数50000以上；

7）文库需呈现核小体pattern，至少需要有核小体free的区域展现；

8）FRiP值需大于0.2；

9）TSS分布图来判断背景信号。

总的来说，就是在文库构建之后，需要对文库进行库检，文库需要符合核小体pattern，即呈现出linker峰、一个核小体峰、两个核小体峰等等，然后测序量需要达到要求，另外，测序后的数据分析，peak数是一个评价标准，最后就是TSS分布图来评估背景。

拿到ATAC-seq测序数据之后，我们要去关注什么？ATAC-seq的结果，通常会分两大类，一类是核小体定位，一类是转录因子。发展到现在，关注转录因子的群体越来越多，通过获得的peak进行motif分析，然后预测motif对应的转录因子来进行后续的研究。当然，基于开放染色质区域通常是基因的启动子调控区域，所以将染色质开放区与基于的表达情况进行关系分析，即ATAC-seq+RNA-seq进行关联分析，来找寻关键的转录因子调控的关键靶基因。

当然了，ATAC-seq联合Hi-C以及组蛋白修饰的数据进行增强子鉴定，又是另外一个故事了。

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参考文献：
[1] Boyle A P , Davis S , Shulha H P , et al. High-Resolution Mapping andCharacterization of Open Chromatin across the Genome[J]. Cell, 2008, 132(2):311-322.

[2] Giresi P G , Kim J , Mcdaniell R M , et al. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin[J]. Genome Research, 2007, 17(6):877-885.

[3]Jeremy, M, Simon, et al. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.[J]. Nature protocols, 2012.

[4] Pajoro A , JM Muiño, Angenent G C , et al. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis[J]. Methods in Molecular Biology, 2017.

[5] Buenrostro J D , Wu B , Chang H Y , et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[J]. Current Protocols in Molecular Biology, 2015, 109(1).

[6] Lee B H , Rhie S K . Molecular and computational approaches to map regulatory elements in 3D chromatin structure[J]. Epigenetics & Chromatin, 2021, 14(1).

[7] Zhang H , Rice M E , JW Alvin, et al. Extensive evaluation of ATAC-seq protocols for native or formaldehyde-fixed nuclei[J]. BMC Genomics, 2022, 23(1):1-18.