新冠疫情快速蔓延，对全球公共卫生安全造成了巨大的威胁，接种安全、有效的新冠疫苗是当下人们的迫切需求。截至2021年7月，全球共有19款新冠疫苗被批准上市，种类包括灭活疫苗、mRNA疫苗、病毒载体疫苗、蛋白亚单位疫苗和减毒活疫苗。另外，有128款疫苗已进入临床实验阶段，其中有11款是DNA疫苗。
DNA疫苗具有易于设计和量产、生产成本低、性质稳定等优点，对比传统类型的疫苗存在明显优势。此外，根据新冠DNA疫苗临床试验发表的数据，DNA疫苗能够很好兼顾有效性与安全性，是未来疫苗研发新趋势，因此对新型新冠DNA疫苗的研发仍在火热进行中。
2021年5月27日，Kit Man Chai等人在《PLOS Neglected Tropical Diseases》期刊发表了文章《DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsters》，研究者通过质粒构建得到6种不同的DNA候选疫苗，并对这些候选疫苗的有效性和安全性进行了系统验证，最后通过动物实验证明了接种DNA疫苗可有效防护新冠病毒感染。这项研究的详细解读如下：
候选DNA疫苗的质粒构建与抗原表达
图1.候选DNA疫苗的质粒构建与抗原表达
实验流程如图图1.所示。研究者首先对SARS-CoV和SARS-CoV-2各构建了一种表达全长S蛋白的质粒。此外，由于抗原表达与疫苗效力密切相关，研究者又对SARS-CoV-2设计了4种不同的Spike基因片段，共得到6种不同的候选疫苗，它们分别为：
1. pSARS-S：表达SARS-CoV全长S蛋白的质粒；
2. pSARS2-S：表达SARS-CoV-2全长S蛋白的质粒；
3. ptSARS2-S：信号肽为组织纤溶酶原激活(tPA)前导序列的SARS-CoV-2全长S蛋白表达质粒；
4. ptRBD：信号肽为tPA前导序列的SARS-CoV-2 RBD表达质粒，RBD表达片段为aa319-aa541；
5. ptRBDTM：信号肽为tPA前导序列的SARS-CoV-2 RBD至跨膜区表达质粒，表达区间片段为aa319-aa1236；
6. ptSdTM：信号肽为tPA前导序列的SARS-CoV-2跨膜结构域缺失的表达质粒，表达区间为aa13-aa1213。
图2. Spike蛋白的蛋白质印迹分析
数据显示（图2）pSARS-S与pSARS2-S皆可在相应的分子量处检测到全长S蛋白。ptSARS2-S、ptRBDTM和ptSdTM变体的表达水平相似，ptRBD的表达水平最高。
候选疫苗的筛选
图3. 候选DNA疫苗的验证方法
1. 评估候选疫苗的有效性与长效性
实验结果显示，pSARS-S和pSARS2-S免疫动物的血清均可识别SARS-CoV-2的全长S区，S2区和RBD区，且IgG抗体滴度相近，但只有pSARS2-S可以引起高水平中和反应（图4.）
此外，为进一步验证pSARS2-S免疫效果，研究者还使用了中和抗体滴度检测试剂盒对血清样本中抗体对ACE2结合RBD的抑制能力进行了评估。结果表明 pSARS2-S免疫可以诱导竞争性抗体，有效地阻断新型冠状病毒RBD与ACE2受体的结合。
图4. 接种pSARS-S和pSARS2-S疫苗免疫小鼠后的抗体反应
研究者还对比了不同候选DNA疫苗的免疫原性，实验结果显示，对全长S蛋白的抗体滴度ptSARS2-S＞ptRBD＞ptSdTM＞ptRBDTM，对RBD的抗体滴度ptRBD＞ptSARS2-S＞ptSdTM＞ptRBDTM。这些不同的变体并没有诱导比pSARS2-S更高的中和抗体水平（图5）。
图.5. 接种SARS-CoV-2不同变体疫苗免疫小鼠后的抗体反应
另外，实验结果显示在小鼠免疫20周后血清中全长S蛋白的IgG滴度无明显变化，中和抗体滴度降幅约18.6%，这意味着pSARS2-S免疫可对新冠状病毒产生了持久的体液应答。
2. 评估疫苗的安全性
根据相关研究报道，Th2细胞反应相较于Th1的免疫反应具有更高的疫苗相关性呼吸道疾病（VAERD）的风险，这意味着偏向Th1的免疫反应所产生的副作用风险可能较低。Th1细胞反应会产生炎性细胞因子(IFN-γ)，而Th2细胞反应可产生细胞因子IL-5和IL-13。研究者通过ELISA方法检测pSARS2-S疫苗注射后小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-5和IL-13的含量，结果发现血清中检测到的子IFN-γ的含量远高于IL-5和IL-13的含量，这意味着注射pSARS2-S DNA疫苗可产生偏向于Th1细胞反应。
综上所述，pSARS2-S疫苗是合适的候选疫苗，可诱导体内产生特异性抗体和中和抗体，并且具有保护效力时间长、安全性好等特点。
pSARS2-S疫苗对SARS-CoV-2的保护效果
图6. DNA疫苗动物模型实验流程
图7. 活病毒攻击三天后检测仓鼠肺中的病毒RNA拷贝数和抗体滴度
总结
在对新冠疫苗火热研发的同时，我们也要关注到新冠病毒不断地在进行新的突变及流行，对疫苗的有效性已经构成了逾加严峻的挑战，因此研究者也需要对突变株疫苗投入更多的研究。
在本研究候选疫苗有效性评估过程中，研究者采用ACROBiossystems提供的中和抗体滴度检测试剂盒（Cat.No.TAS-K022）评估血清样本中抗体对ACE2结合RBD的抑制能力,所得结果与CPE方法检测中和抗体和对SARS-CoV- 2 RBD病毒的ELISA滴度结果一致。
检测原理：
试剂盒应用竞争ELISA方法。样本中的中和抗体与微孔板上固定的Human ACE2 Protein竞争结合HRP-SARS-CoV-2 RBD/Spike，在450nm处测定样本吸光度值（OD450nm），样本OD450nm与样本中中和抗体的含量呈负相关。
产品特点：
> 操作简单，方便可靠
> 可同时检测90+样本
应用场景：
可用于新冠疫苗的研究，血清样本中的中和抗体进行检测等。
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验证数据
图8. TAS-K022 与 FDA 批准的 ELISA 试剂盒的相关性分析
经实验验证，使用上述ELISA试剂盒检测接种疫苗的血清样本对Wild type和B.1.1.7变异株的中和能力接近，但对B.1.351和P.1毒株的中和能力明显下降（图9）。
图9. 新型冠状病毒中和抗体滴度检测试剂盒,包含WT-RBD（Cat. No. RAS-N022）、B.1.1.7 RBD（Cat. No. RAS-N028）、B.1.351 RBD（Cat. No. RAS-N031）、P.1 RBD（Cat. No. RAS-N034）、B.1.1.7 Spike（Cat. No. RAS-N036），B.1.351 Spike（Cat. No. RAS-N037）和P.1 Spike（Cat. No. RAS-N038），检测56份接种疫苗后的血清样本中的中和抗体，以研究疫苗对SARS-CoV-2相关变异株（VOC）的疗效。
参考文献：
1. https://covid19.trackvaccines.org/
2. https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html
3. DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsterss（May 27, 2021）https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009374
4. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines(June 15, 2020)https://doi.org/10.4049/jimmunol.1900517
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