翌圣ZymeEditor平台RPA核心酶原料助力恒温扩增技术升级！
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用参与细胞DNA合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域[1]。
一、RPA技术原理
RPA技术主要依赖于能结合寡核苷酸引物的T4噬菌体来源的重组酶T4 UvsX、单链结合蛋白gp32和链置换Bsu DNA 聚合酶以及两条特异性的上下游引物实现扩增，具体扩增原理如图1所示：
图1.重组酶聚合酶扩增RPA技术扩增原理图[2]
1.重组酶引物复合体的形成：重组酶T4 UvsX在ATP的参与和定位因子（T4 UvsY）的帮助下与扩增引物结合形成重组酶引物复合体，并在双链DNA中寻找同源序列；
2.重组酶引物复合体定位至同源序列：重组酶引物复合体一旦定位到同源序列，则会插入双链DNA形成D-环结构，启动链置换反应，单链结合蛋白gp32会与解开的DNA链结合防止进一步被置换。
3.链置换扩增启动：重组酶T4 UvsX从重组酶引物复合体中被水解，3'端引物暴露并与Bsu DNA聚合酶结合，DNA开始复制延伸，最终两条母链分离，形成两条新的互补双链DNA。该反应在37-42℃下进行，可在30 min内实现目标序列1012倍的扩增。
二、RPA技术优势
1. 检测灵敏度高：可将痕量的核酸模板（低至单拷贝）扩增至可以检出的水平，且通常无需进行核酸纯化。
2. 无需昂贵的配套仪器设备：37~42°C恒温反应，无须热循环，摆脱仪器束缚，方便快捷。
3. 样本耐受性高：适合复杂样本的扩增检测。例如未经核酸纯化的血液或鼻拭子，只需要通过热或碱进行预处理促进核酸释放即可。
4. 检测方法多样化：包括电泳法检测、荧光探针法检测、侧流层析试纸条检测等。
三、RPA技术应用
RPA技术可用于不同种类的目标生物检测，如细菌、真菌、病毒、原生动物等的双链DNA、单链DNA、甲基化DNA以及通过RNA或miRNA反转录产生的cDNA等核酸样本。RPA技术目前已被成功应用于农业、医学、食品、疫病防控等领域，具有广阔的应用前景。
图2.RPA技术应用
四、RPA技术核心酶原料
翌圣ZymeEditor™酶改造平台针对RPA技术，目前已获得RPA全系列性能优良的产品，包括链置换Bsu DNA polymerase、T4 UvsX Recombinase、T4 UvsY protein、T4 gene 32 protein、肌酸激酶Creatine Kinase和Exonuclease III。
翌圣RPA产品选择指南
产品名称产品货号产品作用Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)11078ES结合引物与原始靶核酸序列互补合成新的DNA模板T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)11079ES具有配对和链转移活性的重组酶T4 UvsY protein (2 μg/μL)11080ES重组酶辅助因子，刺激T4 UvsX的单链DNA依赖性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX临界浓度T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌体基因32编码蛋白11081ES参与DNA复制、修复、重组与解链后的单链DNA结合，防止自杂交Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶14502ES刺激ATP和肌酸分解为磷酸肌酸和ADP，释放能量Exonuclease III (100 U/μL)14525ES具有3’→5’外切酶活性，切断荧光探针中淬灭基团，释放荧光
客户测试案例展示
客户采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 进行RPA扩增反应，得到正确的目的条带，且条带清晰、明亮，结果表明，PRA技术核心酶原料可实现高效RPA等温扩增。
图3 客户测试翌圣重组酶聚合酶核心酶原料扩增结果图
注：2、4为阳性实验组；1、3为阴性对照组
参考文献
[1] Zhao Y, Chen F, Li Q, Wang L, Fan C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev. 2015 Nov 25;115(22):12491-545. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00428. Epub 2015 Nov 9. PMID: 26551336.
[2] 王亚楠, 陈昌国. 重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J]. 解放军医学杂志, 2021, 46(5):8.