近年来，利用宏基因组技术研究微生物也受到了科研工作者的关注，成为了研究的热点。到底宏基因组测序该怎么做呢，需要做什么呢？一起来看看美吉生物与同济大学吴志超教授团队合作的佳作：利用宏基因组手段研究膜生物反应器的微生物群落结构、功能以及生物淤积相关基因，相关研究结果已于2016年发表在《Appl Microbiol Biotechnol》（IF：3.34）。

研究背景

膜生物反应器（Membrane Bio-Reactor，MBR）为膜分离技术与生物处理技术有机结合的新型废水处理系统。以膜组件取代传统生物处理技术末端二沉池，在生物反应器中保持高活性污泥（CAS）浓度，提高生物处理有机负荷。在MBR反应池里进行着有机污染物的降解和泥水的分离。作为处理系统的核心部分，反应池里面包括微生物菌落、膜组件、集水系统、出水系统、曝气系统。

MBR主要利用膜分离设备截留水中的活性污泥与大分子有机物。MBR因具有出水水质好、占地面积小和污泥产率低等特点而在污水处理中得到广泛应用。而生物淤积是当前MBR技术快速商业化的一个主要障碍，膜表面的无机物沉淀加快了生物膜滤饼层的形成，从而破坏生物反应器的性能。同时，膜上的沉淀细胞可能会释放更多的胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，比如胞外多糖expolysaccharide，产生不可逆的淤积。

已有研究表明，MBR比CAS中的硝化细菌含量更丰富、更有效。但是我们对MBR微生物功能的了解还非常有限。本文作者进行了一系列研究，以期发现MBR和CAS的微生物多样性和潜在功能，了解MBR的硝化与反硝化作用，同时找到与生物淤积相关的基因。

研究内容

本研究选取上海污水处理厂半工业规模的厌氧/缺氧/有氧（A/A/O）MBR的4个污水和污泥样品，利用上海美吉HiSeq 2500测序平台，分别进行宏基因组测序和生物信息学分析。

取样：

2013年1月7日取样，选取4个不同位置的污水和污泥样品（分布见下图1）：S1（污水）、S2（CAS污泥）、S3（MBE污泥）、S4（生物膜混合液）。

图1. 本研究取样分布示意图

研究结果

1.测序结果

采用HiSeq 2500测序平台，对每个样品进行宏基因组测序，获得了262 M优化数据。每个样品的组装信息见下表1。

表1. 各样品测序组装结果信息统计表

2. COG功能注释

研究结果表明，在25类COG功能注释结果中（如图2所示），[J]翻译、核糖体结构及起源、 [K]转录和[R]一般功能是最主要的三大类（图a标红框部分）。由于S2（来源于CAS活性污泥）和S3（来源于MBR活性污泥）均是处理相同的城市废水，所以可发现二者的潜在功能是非常相似的（图b）。

图2. COG功能注释结果，（a）基因水平；（b）序列水平

3.样本中的微生物结构的分析

通过两种方法（SSU rRNA 基因法和蛋白预测法）分别对4个样品的微生物组成进行分析，结果如图3所示：在门水平上，丰度最高的是变形菌门（Proteobacteria），其次是拟杆菌门（Bacteroidetes），再次是厚壁菌门（Firmicutes），三者比例之和为77.2%。用蛋白预测法所得的结果显示，Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes与Spirochaetes是丰度最高的4个菌门。此外，还发现有24个属，在所有样本中丰度均大于1%（图3b）。

图3. SSU rRNA 基因法和蛋白预测法获得的微生物组成分析结果，（a）为门水平，（b）为属水平

4.基因预测

Flavobacterium、Thauera和 Dechloromonas的基因预测结果如图4所示。由图可知，预测基因的丰度大部分是相似的，比如复制、重组、修复；能量产生与转化等。同时，也有部分基因丰度是有差异的，比如黄杆菌属（Flavobacterium）中关于氨基酸和无机离子运输和代谢的基因更加丰富。相比较之下，索氏菌属Thauera和Dechloromonas主要与信号转导机制相关。

图4. 基于COG注释的Flavobacterium, Thauera, 和 Dechloromonas的基因预测分析

5.氮代谢通路的研究

S1-S3样品中，与氮代谢途径相关的功能包括硝化、反硝化作用和铵**盐还原（如图5）。如图5e统计了相关编码基因的丰度信息，主要是氨单加氧酶（amo）、羟胺氧化酶（hao）、**还原酶（nar）、亚**盐还原酶（nir）、一氧化氮还原酶（nor）、一氧化二氮还原酶（nos）等。结果显示，污水样本（S2、S3）中**盐异化还原为铵（DNRA）明显受到抑制，这表明MBR中的**/亚**盐的还原过程是通过反硝化作用实现的。

图5. KEGG氮代谢通路结果：（a）细菌的硝化作用；（b）细菌的反硝化作用；（c）古菌的反硝化作用；（d）**盐还原为氨过程；（e）基因的相对丰度情况

主要结论

1、MBR中的微生物非常丰富。特别是对优势物种的功能分析后，作者发现不同种系的共同基因具有重要的潜在功能，比如检测到某个物种的基因发生了变异。

2、由于处理相同的污水，MBR与CAS系统保持着相似的潜在代谢功能，但是MBR中的硝化微生物更加丰富，而且氨单加氧酶编码基因增多。这可能很好地解释了低温条件下，MBR的除氨能力较好的原因。

3、基于胞外多糖和EPS蛋白代谢相关的基因表达量结果，作者并未发现MBR中具有特殊潜在的可产生EPS的基因；与MBR中的活性污泥相比，生物膜中细菌的基因丰度降低，比如与EPS生物合成与转运相关基因丰度降低。

参考文献

Ma J, Wang Z, Li H, et al. Metagenomes reveal microbial structures, functional potentials, and biofouling-related genes in a membrane bioreactor[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2016: 1-13.